背景
丙型肝炎病*(HCV)通常会引起肝脏慢性感染、肝硬化，在某些情况下还会引起肝细胞癌(HCC)。HCV编码几种损害宿主基因以建立慢性感染的因子。长链非编码RNA(lncRNAs)对生物调控表现出多种效应。然而，对它们在病*复制和潜在疾病中的作用了解甚少。在这项研究中，我们发现HCV利用肝细胞中的lncRNALinc-Pint来增强脂肪生成。
简介
年11月24日，来自美国密苏里州圣路易斯大学的RanjitRayandRatnaB.Ray等人在Hepatology（IF:14.）杂志上发表了一篇名为InhibitionoflongnoncodingRNALinc-PintbyhepatitisCvirusininfectedhepatocytesenhanceslipogenesis的研究[1]。在本研究中，我们证明了Linc-Pint通过与RNA结合蛋白SRPK2相互作用抑制HCV复制和病*诱导的脂肪生成。本研究有助于从机制上理解Linc-Pint在丙型肝炎病*相关性肝脏发病机制中未被探索的作用。
主要结果
Linc-Pint在HCV感染的肝细胞中下调
用HCVJFH1(moi-1.0)感染Huh7细胞，并在感染60小时后分离总RNA。以空白处理细胞的RNA作为阴性对照。与对照组细胞相比，HCV感染的肝细胞中Linc-Pint表达显著下调(图1，A图)。我们比较了携带基因组长度HCV(Rep2a)的Huh7.5细胞或Huh7.5细胞RNA的Linc-Pint表达。观察到Rep2a细胞中Linc-Pint表达显著下调(图1，B图)。为了检测Linc-Pitt在另一种*病*中的状态，我们检测了模拟处理或感染寨卡病*的角质形成细胞和巨噬细胞的RNA中的Linc-Pitt表达。通过qRT-PCR检测确定了寨卡病*感染，但我们没有观察到Linc-Pint的改变。进一步检查了慢性HCV感染的人肝脏活检标本和非病*性肝脏活检标本中的Linc-pint表达，并观察到Linc-Pint表达下调(图1，C图)。
Linc-Pint过表达抑制细胞增殖
接下来，我们检查了Linc-Pint对细胞增殖的影响。将对照空载体(pcDNA3)或Linc-Pint质粒DNA转染IHH或Huh7细胞，用台盼蓝排除排法计数细胞数。与载体转染的对照细胞相比，我们在用Linc-Pint转染的IHH和Huh7细胞中观察到细胞增殖的显著抑制(图1，D图)。
图1.HCV感染会下调Linc-Pint的表达。(A)Huh7细胞感染了HCV-JFH1(moi=1.0)。从模拟处理或感染的细胞中分离总RNA，并通过实时PCR测定Linc-Pint和18秒rRNA。(B)从Huh7.5细胞和Huh7.5细胞中分离到携带有基因组长度HCV复制子(Rep2a)的RNA，并通过实时PCR检测Linc-Pint的表达。(C)在HCV感染的肝活检标本(n=11)的RNA中检测Linc-Pint表达，并通过qRT-PCT与非病*性肝活检标本(n=8)进行比较。(D)用对照(pcDNA3载体)或pcDNA3-Linc-Pint质粒DNA转染肝细胞(Huh7或IHH)。在指定时间点计数细胞数。数值代表三个独立实验的数据，均数±标准差。采用双侧Student’st检验分析统计显著性；*P0.05，***p0.span=""。
Linc-Pint与SRPK2蛋白结合
Linc-Pint由p53转录诱导，并通过与PRC2相互作用，抑制癌细胞迁移和浸润。然而，我们对Linc-Pint的相互作用蛋白知之甚少，尤其是在病*感染的情况下。为了确定Linc-Pitt的相互作用配偶体，我们使用Linc-Pitt的生物素标记的有义和反义RNA进行RNApull-down试验，并用质谱分析该复合物。为了以图形方式表示我们的蛋白质组学数据，构建了有义/反义光谱计数的火山图–log10(P值)对比log2(倍数)变化，以显示定量数据(图2，A图-左)。我们确定，与质谱分析中的反义链(11.8倍)相比，SRPK2蛋白是Linc-Pint有义链中具有高光谱计数的相互作用配偶体之一(图2，A图-右)。已证实SRPK2可磷酸化参与mRNA前体剪接的富含丝氨酸/精氨酸(SR)的蛋白，从而调节mRNA前体的加工、成熟和稳定性。SRPK2在多种癌症中高度表达，在肿瘤的进展和转移中也起着重要的作用。接下来，我们使用从IHH裂解液中提取的生物素化的有义或反义Linc-PintRNA验证RNA-蛋白质相互作用，然后用SRPK2抗体进行蛋白质印迹分析。我们观察到肝细胞中SRPK2蛋白与Linc-Pint有义链存在关联(图2，B图)。为了进一步确认Linc-Pitt与SRPK2之间的相互作用，我们在超量表达IHH的Linc-Pitt中使用SRPK2抗体或同型对照抗体进行了相互免疫沉淀分析，然后使用特异性引物进行qRT-PCR。与同型对照抗体的RNA相比，使用IHH或Huh7细胞从SRPK2抗体免疫沉淀的RNA中观察到Linc-PintRNA的显著富集(图2，C图)。这些数据表明Linc-Pint与SRPK2蛋白之间存在相互作用。
高表达Linc-Pint下调肝细胞中SRPK2的表达
为了探索在高表达Linc-Pint肝细胞中的SRPK2状态。为此，将Linc-Pint或对照质粒DNA转染到IHH和Huh7细胞中。细胞裂解物使用特异性抗体通过蛋白质印迹分析。在高表达Linc-Pint细胞中观察到SRPK2蛋白水平显著下调(图2，D图)。然而，在高表达Linc-Pint细胞中，我们未观察到SRPK2mRNA水平的改变(图2，E图)。接下来，我们检查了高表达Linc-Pint是否会改变SRPK2的稳定性。为此，使用载体(DMSO)或MG蛋白酶体抑制剂处理过的Linc-Pint过表达IHH或Huh7细胞。我们的结果显示，在Linc-Pint存在的情况下，MG治疗后SRPK2抑制减轻(图2，F图)，这表明Linc-Pint可能通过蛋白酶体降解在蛋白水平下调SRPK2的表达，未来研究可通过进一步的工作来阐明其机制。
我们进一步确定了Linc-Pint基因上负责SRPK2相互作用的特定区域。使用计算机快速算法[tartaglialab.