乙型病毒性肝炎

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微课堂猪流行性乙型脑炎检测诊断技术 [复制链接]

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流行性乙型脑炎又名日本乙型脑炎,简称乙脑,是由日本乙型脑炎病*(JapaneseEncephalitisVirus,JEV)引起的一种急性人兽共患传染病。

病原特征

乙型脑炎病*属*病*科*病*属,呈球型,单股正链RNA病*,有囊膜。病*基因组全长约11kb,共编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白,结构蛋白分别为:C蛋白、PrM蛋白、E蛋白;非结构蛋白分别为:NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B,NS5。乙型脑炎病*抵抗力不强,对温度、乙醚及各种消*剂等都很敏感,56℃30分钟、℃2分钟的条件均可将乙脑病*灭活。但能耐受低温和干燥。

流行病学

乙脑发病具有明显季节性,多见于每年夏秋季节,主要靠蚊虫叮咬传播。许多动物和人均可感染本病,但多为隐性感染,特别是牛和羊。病畜以及隐性感染的人畜在病*血症阶段都可成为传染源,其中猪是最主要的传染源。在本病流行期间,猪的感染率可达%。

临床诊断

1.临床症状猪感染乙脑后潜伏期较短,发病迅速,表现为稽留热,精神沉郁,食欲下降,但饮欲增加。也有的猪只表现出神经症状,如视力下降、冲撞、四肢麻痹并倒地死亡;妊娠母猪的流产则是乙脑对猪群的另一严重危害,可观察到流产母猪的阴道内流出红褐色的黏稠液体,病猪表现出胎衣不下,产出木乃伊状胎儿,或濒于死亡胎儿,存活下来的仔猪即使外表正常,但站立和采食困难;而公猪还会发生单侧性睾丸炎,一侧睾丸发生明显肿大。人感染乙脑后,潜伏期一般为1~2周,多数患者并不表现出明显症状或呈隐性感染,仅有少数病人出现症状,主要为中枢神经系统异常,如出现发热、意识障碍、惊厥等。2.病理变化发病猪病变主要在脑、睾丸和子宫,表现为脑脊液增加,脑实质充血、出血;公猪睾丸肿胀、充血、出血、坏死;子宫内膜充血、出血;流产胎儿大小不一,成木乃伊化,并可观察到脑水肿及皮下的血样浸润,部分胎儿可见到大脑或小脑发育不全。根据流行病学、临床症状和病理变化可以进行初步诊断,如果要进行确诊还要进行实验室检测诊断。

实验室检测诊断

1.检测诊断标准(现行)表1乙型脑炎检测标准2.检测诊断方法(1)病*的分离和鉴定在流行和发病早期,无菌采集发病动物的血液或脑脊髓液;在动物死亡后,可无菌采取大脑组织;流产母猪采取流产死胎脑组织。血液样品需要制备出血清或血浆,组织样品需研磨匀浆,制成10%的悬液,接种乳鼠脑组织或易感细胞。然后观察鼠的症状,死亡的鼠再次制备组织样品进行传代和病*鉴定。细胞接种12h后观察细胞的形态,并做相应的记录及病*鉴定,血清学检查及PCR核酸分析。(2)血清学诊断检测乙脑感染动物或患者的血清、脑脊液中是否含有乙脑病*的特异性抗体,是血清学诊断方法的主要目的,如补体结合试验、血凝抑制试验、中和试验、乳胶凝集试验、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验等。血清学方法可以用于乙脑病*感染确诊。补体结合试验:将待检血清、标准阳性血清、标准阴性血清作1:4稀释后,62℃灭活30min。2倍连续系列稀释后加入抗原,同时设置抗原对照、红细胞对照、补体对照和血清抗补体对照。加入2单位补体4℃放置18h或过夜。加入致敏红细胞37℃水浴30min。结果判定:能达到50%抑制溶血的血清最高稀释倍数即为该血清的效价;被检血清稀释度1:16以上能达到50%溶血时判为阳性。血凝抑制试验:将待检血清62℃灭活30min,加入PH9.0的硼酸氯化钠溶液和25%的高岭土溶液37℃1h或4℃过夜。取上述血清按1/50体积量加入鹅红细胞泥混匀,冰浴20min,取上清。设置阳性、阴性、抗原、红细胞对照。加入抗原室温放置60min。加入红细胞37℃放置60min后判读。以能完全抑制红细胞凝集的最高血清稀释度作为该被检血清的血凝抑制抗体效价。中和试验:待检血清62℃灭活30min。将病*配制成PFU/ml,再分别与标准血清和待检血清等量混合孵育1.5h。取混合液接种于单层HK-21细胞孵育1.5h,加入培养液培养5d。再加入1%结晶紫μL,37℃染色1h。于倒置显微镜下观察蚀斑数。蚀斑减数率=(阴性蚀斑数-待检血清蚀斑数)/阴性蚀斑数/%,蚀斑减数率大于50%的血清判为阳性。乳胶凝集试验:将待检血清作2倍连续稀释,至少做4个滴度。设阳性血清、阴性血清、稀释液对照。再加乳胶凝集抗原混匀,搅拌并摇动1-2min,并与3-5min内观察结果。以出现“++”以上的最大稀释倍数为凝集价。凝集价为1:4以上者判为阳性;1:2为疑似,疑似者重做,仍为疑似判为阳性。间接免疫荧光试验:将病*液接种于单层Vero细胞37℃吸附1.5h,加入含2%小牛血清维持液继续培养2d~3d。待细胞病变达到50%时,进行漂洗,固定和干燥。加相应荧光抗体37℃湿盒中作用30min,漂洗、封片,在荧光显微镜下观察。细胞浆内出现特异性的亮绿色或*绿色颗粒状或团块状荧光者判为阳性。细胞核呈暗黑色,细胞浆呈橘红色且无特异性绿色荧光判为阴性。酶联免疫吸附试验:将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面,使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将液相中的游离成分洗除。加入底物溶液,底物在酶作用下出现颜色反应。通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应,颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定。(3)RT-PCR诊断在感染早期的乙脑诊断中,RT-PCR方法有比免疫学方法更为重要的应用价值。全血,脑脊液,细胞培养物等液状样品可直接用于检测。表2RT-PCR试验引物序列

表3中科基因猪乙型脑炎病*检测能力

中科基因全国实验室检测分布图

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北京中科基因技术有限公司检测技术分公司

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